當(dāng)前，NextSeq2000可以提供以下測序能力服務(wù)：
通過對(duì)比Miseq測序數(shù)據(jù)，NextSeq2000 產(chǎn)出的2×300 bp數(shù)據(jù)無論在測序質(zhì)量Q30，還是結(jié)果一致性上均達(dá)到并超出（如下圖），可以完全替代Miseq測序平臺(tái)提供更高性價(jià)比的測序解決方案。
價(jià)格和周期：
| 分類 | 類型 | 價(jià)格 | TAT |
| 樣本純化 | 磁珠純化 | 100 | 2-3工作日 |
| illumina建庫 | DNA小片段文庫 | 200 | 2-3工作日 |
| 測序 | PE300/PE250 (M) | 220 | 3-5工作日 |
]]>備注：
1. 建庫費(fèi)用含QC費(fèi)用。核酸通過QC的樣品，建庫成功按照正常流程收費(fèi)，若建庫失敗不收取費(fèi)用（默認(rèn)嘗試兩次）；
2. 客戶樣品評(píng)為風(fēng)險(xiǎn)建庫或者不合格樣品時(shí)，客戶繼續(xù)要求建庫的，無論結(jié)果成功與否；每輪建庫正常收取一次建庫費(fèi)用；
3. Illumina PE300/250散樣測序1M reads數(shù)據(jù)量起接單, 暫時(shí)不接包lane測序，默認(rèn)發(fā)貨為PF data.
4. Illumina雙鏈散樣DNA文庫要求總量＞50ng（去除用于質(zhì)檢的2ul后）,濃度＞2.5ng/ul；包lane要求總量＞150ng，濃度＞3ng/μL。
抗體是獲得性免疫的重要組成部分，在防御性及致病性的免疫反應(yīng)中起到關(guān)鍵作用，又因其具有高度靶向特異性、親和力和安全性,已經(jīng)在許多重大疾病的治療、診斷和預(yù)防中得到廣泛應(yīng)用, 是當(dāng)今新藥研發(fā)的一個(gè)重點(diǎn)。而獲得醫(yī)用單克隆抗體或抗體片段的基因序列是進(jìn)行抗體工程及抗體人源化改造的前提，是實(shí)現(xiàn)其功能優(yōu)化至關(guān)重要的第一步。DNA測序技術(shù)的長足發(fā)展為獲取抗體基因奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，特別是隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展和成熟，使得分析抗體基因序列,特別是針對(duì)大容量、多樣性高的抗體基因庫序列的系統(tǒng)分析成為可能。
高通量測序概要
高通量技術(shù)堪稱測序技術(shù)發(fā)展的一個(gè)里程碑，該技術(shù)可以對(duì)數(shù)百萬個(gè)DNA分子同時(shí)進(jìn)行測序。使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行全貌分析成為可能，因此也稱為深度測序（deep sequencing）或者下一代測序（next generation sequencing）。 高通量測序最具代表性測序平臺(tái)有三種（圖2）：1，2005年454 Life Sciences公司推出的454 FLX焦磷酸測序平臺(tái)（454 FLX pyrosequencing platform），2006年Illumina公司推出的Solexa基因組分析平臺(tái)（Genome Analyzer platform），以及2007年ABI公司推出的SOLiD測序儀（ABI SOLiD sequencer），他們的共同點(diǎn)是都具有高測序通量，根據(jù)平臺(tái)不同讀取長度從25bp到450bp不等，這樣一次可以讀取到1G到14G不等的堿基信息，這是傳統(tǒng)的96道毛細(xì)管測序無法達(dá)到的。由此可見第二代測序技術(shù)無需進(jìn)行電泳，操作簡便。這不但大大節(jié)省了成本和時(shí)間，而且可以對(duì)數(shù)以百萬計(jì)的樣品進(jìn)行分析，這樣龐大的測序能力是傳統(tǒng)測序儀所不能比擬的。
圖2 三種具有代表性的 高通量測序技術(shù)
DNA測序技術(shù)在抗體研發(fā)的發(fā)展歷程
隨著測序技術(shù)的發(fā)展，抗體組學(xué)的研究經(jīng)歷了從低通量到高通量的技術(shù)變革。在1990~2000年間，主要利用RT-PCR擴(kuò)增技術(shù)和Sanger測序技術(shù)研究少量B細(xì)胞的抗體特征。由于技術(shù)的低通量性，每次實(shí)驗(yàn)只能分析幾十到幾百個(gè)B細(xì)胞的抗體特性，與抗體譜的巨大數(shù)據(jù)相比，低通量技術(shù)只為我們揭示了抗體序列信息的冰山一角。
2009年Weinstein等首次應(yīng)用高通量測序技術(shù)全面研究了斑馬魚的抗體庫特征，揭示不同斑馬魚個(gè)體間重鏈VDJ基因的使用頻率存在相似性，促進(jìn)了高通量測序技術(shù)在人抗體組分析中的應(yīng)用。下一代測序技術(shù)的應(yīng)用使得一次測序可獲得數(shù)以百萬計(jì)的B細(xì)胞的抗體可變區(qū)域序列，數(shù)據(jù)量更加接近人體抗體譜真實(shí)數(shù)量，抗體的研究從而進(jìn)入大數(shù)據(jù)時(shí)代。
高通量DNA測序技術(shù)在抗體領(lǐng)域中的應(yīng)用
大容量和多樣性好的抗體基因庫是成功篩選功能抗體的基礎(chǔ)。目前用于基因庫篩選的所有展示技術(shù)均采用了一種表型選擇壓力的原理,即依賴于受體-配體的競爭結(jié)合力,這樣的篩選過程一方面通過展示技術(shù)富集了目標(biāo)抗體基因,另一方面可能導(dǎo)致篩選環(huán)節(jié)中的一些稀有分子、低結(jié)合力分子、可溶性表達(dá)量過低的分子或產(chǎn)量較低的抗體基因被漏篩。例如在篩選抗病毒的中和性抗體過程中,經(jīng)常發(fā)現(xiàn)獲得的高親和力抗體沒有較好的中和作用,這是因?yàn)楂@得的高親和力抗體并不是針對(duì)中和作用的靶標(biāo),因而獲得的抗體是不相關(guān)的抗體。
而DNA測序過程沒有選擇壓力,可以釋放較完整的基因庫的序列信息,有利于捕獲目標(biāo)基因。傳統(tǒng)的Sanger法在DNA測序的通量上一般最大為100kb,96孔,遠(yuǎn)不能滿足庫容在109分子以上的抗體基因庫分析的需求,而新一代高通量DNA測序技術(shù)的出現(xiàn)為實(shí)現(xiàn)抗體基因庫測序提供了可能。
近年來高通量DNA測序技術(shù)在抗體領(lǐng)域中的應(yīng)用不斷增加,目前主要集中在對(duì)重組抗體庫多樣性的分析及基于抗體可變區(qū)CDR3序列測序結(jié)果的應(yīng)用。
展望
隨著高通量DNA測序技術(shù)發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)及重組抗體技術(shù)的不斷完善，快速檢測大容量重組抗體基因庫及快速發(fā)現(xiàn)藥用抗體基因的時(shí)代到來，對(duì)整個(gè)抗體藥物研發(fā)產(chǎn)生巨大推動(dòng)作用。但到目前為止，抗體組學(xué)分析技術(shù)仍受到一些現(xiàn)實(shí)條件的約束，如高通量PCR抗體基因擴(kuò)增技術(shù)仍不夠完善、測序讀段長度與準(zhǔn)確性還有待進(jìn)一步提高、標(biāo)準(zhǔn)的分析流程有待開發(fā)完善。隨著單細(xì)胞分選及測序的應(yīng)用、PCR擴(kuò)增基因方法的改善、細(xì)胞標(biāo)記的應(yīng)用、分析標(biāo)準(zhǔn)的開發(fā)，未來抗體組學(xué)將在診斷、藥理學(xué)、疫苗設(shè)計(jì)及臨床應(yīng)用中發(fā)揮重大作用，引領(lǐng)新型治療性抗體研究的時(shí)代。
蘇州百達(dá)提供的服務(wù)
基于5’RACE全面準(zhǔn)確的建庫方法和Miseq測序平臺(tái)的高質(zhì)量，高通量的測序能力，我們能夠提供快速準(zhǔn)確地抗體基因發(fā)現(xiàn)服務(wù)：
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京房生物與上海交大陶生策教授團(tuán)隊(duì)以及趙小東教授團(tuán)隊(duì)合作攻關(guān)了一套名為AbMap的高通量抗體表位解析技術(shù)(圖1)。該技術(shù)處于世界領(lǐng)先地位，能夠?qū)崿F(xiàn)在一個(gè)月內(nèi)對(duì)1000+抗體的表位解析！該研究成果于2020年底發(fā)表于國際蛋白質(zhì)組學(xué)權(quán)威期刊Molecular & Cellular Proteomics (MCP)上，論文題為《Antibody binding epitope Mapping (AbMap) of hundred antibodies in a single run》。
圖1 AbMap技術(shù)原理
緊隨其后，京房生物與二位教授團(tuán)隊(duì)使用AbMap技術(shù)解析了明星抗腫瘤藥物Sintilimab (PD-1單抗)的抗原結(jié)合表位，發(fā)現(xiàn)氨基酸序列SLAPKA是PD-1中最為關(guān)鍵的Sintilimab結(jié)合部位(圖2)。這項(xiàng)工作為產(chǎn)生高效的PD-1抗體藥物打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。該論文發(fā)表于SCI期刊Acta Biochimica et Biophysica Sinica，論文題為《The binding epitope of sintilimab on PD-1 revealed by AbMap》。
圖2 Sintilimab的PD-1結(jié)合表位
馬不停蹄，京房生物隨即又和二位教授團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)的解析了肆虐全球的新型冠狀病毒SARS-CoV-2的抗原結(jié)合表位，鑒定并驗(yàn)證了一批顯著表位(圖3)。這項(xiàng)工作為生產(chǎn)新型流感疫苗打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。該論文發(fā)表于免疫學(xué)領(lǐng)域權(quán)威期刊Cellular & Molecular Immunology，論文題為《Systematic profiling of SARS-CoV-2-specific IgG epitopes at amino acid resolution》。 京房生物創(chuàng)始人為這三項(xiàng)研究的共同通訊作者。
圖3 使用AbMap鑒定并用蛋白芯片驗(yàn)證了的顯著表位
國際在線報(bào)道（記者 魏郁）：日前，一款具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新冠肺炎治療性抗體新藥在歐盟和美國獲批緊急使用。研發(fā)團(tuán)隊(duì)核心成員、中科院微生物研究所研究員嚴(yán)景華在接受總臺(tái)記者專訪時(shí)表示，這標(biāo)志著具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新冠病毒特異性抗體藥物安全性和有效性獲得世界性認(rèn)可，也是中國的創(chuàng)新藥物走向全球市場的有益嘗試。
記者從中國科學(xué)院微生物研究所獲悉，歐洲藥品管理局人類用醫(yī)藥產(chǎn)品委員會(huì)近日允許歐盟成員國，在公共衛(wèi)生緊急情況下使用單克隆抗體LY-CoV555與LY-CoV016的聯(lián)合療法（“抗體雞尾酒”療法）應(yīng)對(duì)新冠肺炎患者，其中，LY-CoV016由中科院微生物所與君實(shí)生物聯(lián)合研發(fā)。此前，美國食品藥品監(jiān)督管理局已于2月上旬批準(zhǔn)該療法的藥物在美國的緊急使用授權(quán)。
圖為單克隆抗體聯(lián)合療法藥物，紅色為中科院微生物所與君實(shí)生物聯(lián)合研發(fā)的LY-CoV016，黑色為LY-CoV555 .
LY-CoV016研發(fā)團(tuán)隊(duì)核心成員、中科院微生物研究所研究員嚴(yán)景華介紹說，LY-CoV016是一種特異性單克隆中和抗體，這種抗體被譽(yù)為瞄準(zhǔn)新冠病毒的“生物導(dǎo)彈”，對(duì)新冠肺炎的治療和預(yù)防都有特效，“我們知道，病毒要進(jìn)入細(xì)胞，需要有一個(gè)受體，（并且要）跟受體之間進(jìn)行相互作用。在作用過程中，如果有一個(gè)抗體結(jié)合在病毒和受體之間，它就阻斷了這個(gè)（作用）過程，病毒也就不能感染。其實(shí)它像什么呢？就像‘一把鑰匙開一把鎖’，類似于鎖眼被堵上了，打不開這個(gè)‘門’，就阻斷了病毒和受體之間的相互作用。它是一個(gè)特效藥，又是個(gè)生物藥。所以（形象地）說它是一個(gè)‘生物導(dǎo)彈’?！?
嚴(yán)景華介紹說，中科院微生物所在新冠肺炎疫情暴發(fā)初期就著手布局單克隆抗體研發(fā)，并得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃的立項(xiàng)支持。研發(fā)團(tuán)隊(duì)發(fā)揮在新發(fā)傳染病抗體研究方面多年積累的經(jīng)驗(yàn)和優(yōu)勢，經(jīng)過不懈攻關(guān)，以及與企業(yè)的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化團(tuán)隊(duì)高效合作，實(shí)現(xiàn)了這款特效藥的規(guī)模化生產(chǎn)。“對(duì)于突發(fā)傳染病而言，藥物研發(fā)最大的難點(diǎn)是什么？就是要快。我們中科院微生物所團(tuán)隊(duì)，一直在做新發(fā)傳染病的病毒性中和抗體（研究工作），包括（針對(duì)）寨卡病毒、MERS抗體篩選工作，（因此）我們有這樣一個(gè)平臺(tái)技術(shù)（優(yōu)勢）。我們的技術(shù)平臺(tái)就是單細(xì)胞測序，從康復(fù)病人的免疫細(xì)胞里面找到一些能夠分泌針對(duì)新冠病毒的抗體，然后分離、測序、生產(chǎn)，這個(gè)是需要非常快速的一個(gè)過程。從科研機(jī)構(gòu)的成果，用差不多一年的時(shí)間就走向了全球市場的應(yīng)用，是非常不容易的一件事?！?/p>
據(jù)悉，2020年3月，中科院微生物所將LY-CoV016抗體的商業(yè)開發(fā)權(quán)授予君實(shí)生物。2020年5月，經(jīng)中科院微生物所同意，君實(shí)生物與美國禮來制藥公司達(dá)成合作協(xié)議，由禮來制藥推進(jìn)該藥物的臨床實(shí)驗(yàn)。2020年6月，LY-CoV016同步獲得中國國家藥品監(jiān)督管理局和美國食品藥品監(jiān)督管理局臨床試驗(yàn)許可，成為全球首個(gè)完成非人靈長類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)后，在健康人群中開展的新冠肺炎治療性抗體臨床試驗(yàn)。嚴(yán)景華介紹說，根據(jù)禮來制藥披露的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)，LY-CoV016與LY-CoV555聯(lián)用能顯著降低病毒滴度，且改善了臨床癥狀，“從臨床實(shí)驗(yàn)來講，在隨機(jī)雙盲試驗(yàn)中，死亡病例沒有了，住院和轉(zhuǎn)重癥的比例降低了70%。在這種情況下，就是歐盟也好，美國FDA也好，（正是）基于這個(gè)三期臨床試驗(yàn)的數(shù)據(jù)結(jié)果，所以批準(zhǔn)了緊急使用。”
嚴(yán)景華表示，新冠治療性抗體新藥聯(lián)合治療方法被美國食品藥品監(jiān)督管理局和歐洲藥品管理局相繼批準(zhǔn)緊急使用，標(biāo)志著具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新冠病毒特異性抗體藥物安全性和有效性獲得世界性認(rèn)可，也是中國的創(chuàng)新藥物走向全球市場的有益嘗試。“對(duì)于研發(fā)人員來講，（這個(gè)特效藥）能夠在美國歐盟參與救治病人，我們覺得是非常欣慰的事情。這樣一個(gè)我們（中國）具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的原創(chuàng)新藥，我認(rèn)為是產(chǎn)、學(xué)、研、醫(yī)緊密合作的共贏。從全球的藥物研發(fā)來講，中國的原創(chuàng)藥實(shí)際上還是比較少，對(duì)于中國的藥企、研發(fā)單位要走向國際大舞臺(tái)，在藥物市場領(lǐng)域占據(jù)自己的地位，也是一個(gè)很好的范例?！?
]]>剛過去的2020年對(duì)于中國和世界來說都是不平凡的一年。從2020年年初爆發(fā)新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）疫情至今，全球累計(jì)確診病例已超8423萬，死亡人數(shù)超180萬例。更令人擔(dān)憂的是，去年12月份在英國等地陸續(xù)出現(xiàn)了變異新冠病毒，該變異毒株的傳播速度相比其他6種毒株要快70%，極大地加劇了全球緊張的防疫形勢。目前有許多疫苗正在臨床或臨床前研究中，也有幾款疫苗趕在2021年前獲批上市，包括中國國藥集團(tuán)的新冠病毒滅活疫苗，英國牛津-阿斯利康新冠疫苗和美國輝瑞公司的新冠候選疫苗。由于疫苗通常需要數(shù)周的時(shí)間才能為一個(gè)健康的人提供完全保護(hù)，并且對(duì)于免疫系統(tǒng)較弱或受損的人群，疫苗的效果要大打折扣；因此，在疫苗研發(fā)的基礎(chǔ)上，仍亟需開發(fā)針對(duì)COVID-19的治療藥物以應(yīng)對(duì)疫情。中和抗體由于其特異性好、療效高、安全性高等特性成為新冠藥物開發(fā)的熱點(diǎn)。美國總統(tǒng)特朗普在感染新冠后，就曾接受了來自于美國再生元公司的雞尾酒抗體REGN-COV2的治療。目前，多家公司的新冠中和抗體藥物臨床研究也顯示出良好的治療潛力。
近日，華人抗體協(xié)會(huì)旗下期刊、牛津大學(xué)出版社出版的Antibody Therapeutics發(fā)表了一篇原文標(biāo)題為“Neutralizing antibodies against SARS-CoV-2: current understanding, challenge and perspective”的綜述論文。通訊作者是來自廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院夏寧邵教授團(tuán)隊(duì)的高級(jí)工程師鄭清炳博士。
論文摘要和亮點(diǎn)
目前已經(jīng)報(bào)道了許多具有治療潛力的SARS-CoV-2中和抗體（NAbs），并且相關(guān)科研工作者正加速推進(jìn)針對(duì)SARS-CoV-2的抗體療法的臨床前和臨床研究。本文提供了SARS-CoV-2特異性或交叉反應(yīng)性NAbs的系統(tǒng)概述，并重點(diǎn)討論了它們的結(jié)構(gòu)研究、抗體功能及中和機(jī)制。同時(shí)，作者也總結(jié)了NAb療法所面臨的挑戰(zhàn)，例如抗體依賴增強(qiáng)癥（ADE）和病毒逃逸突變等。
論文主要內(nèi)容
中和抗體在清除COVID-19患者體內(nèi)的病毒中起著重要作用。近幾個(gè)月來，報(bào)道了許多SARS-CoV-2的NAbs，這促進(jìn)了基于NAbs的免疫療法在治療COVID-19中的應(yīng)用。研究表明，COVID-19患者的NAbs滴度與靶向刺突糖蛋白（Spike glycoprotein）受體結(jié)合區(qū)域（RBD）的免疫球蛋白IgG的濃度密切相關(guān)，這表明刺突蛋白上的RBD可能包含主要的中和表位。針對(duì)目前已報(bào)道并且復(fù)合物結(jié)構(gòu)已發(fā)布在Protein Data Bank上的靶向RBD的抗體，作者提出了有關(guān)這些NAbs如何特異性識(shí)別SARS-CoV-2的RBD或與其他型冠狀病毒的交叉反應(yīng)性的獨(dú)特見解。
依據(jù)抗體所能結(jié)合的S三聚體的構(gòu)象，作者將抗體分為四類（圖1），分別是，分類一：只能靶向處于‘up’狀態(tài)的RBD（如REGN10933，CB6，CV30等）；分類二：只能靶向處于‘up’狀態(tài)且順時(shí)針相鄰的RBD同時(shí)處于‘up’狀態(tài)的RBD（如CR3022，EY6A，VHH-72）；分類三：只能靶向處于‘down’狀態(tài)的RBD（如Fab2-4，BD23等）；分類四：能同時(shí)靶向處于‘up’及‘down’狀態(tài)的RBD（如S309，H11-H4，REGN10987等）。有意思的是，作者指出，這些歸為相同類型的抗體具有某些相似的特征和中和機(jī)制，例如分類一的抗體大部分都具有相同的重鏈V基因家系（IGHV3-53），并且均通過阻斷受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶II（ACE2）與RBD的結(jié)合來中和病毒；分類二的抗體靶向高度保守的隱蔽表位，因此均能夠交叉中和SARS-CoV和SARS-CoV-2；分類三的抗體則靶向含糖基表位，并且糖鏈對(duì)于抗體的結(jié)合起重要作用，抗體能夠?qū)BD鎖定在‘down’狀態(tài)并使ACE2結(jié)合區(qū)域不可及。
除了靶向RBD的NAbs外，也有針對(duì)非RBD的NAbs報(bào)導(dǎo)，例如靶向N末端區(qū)（NTD）的4A8，COV57，2-17等抗體及靶向S2區(qū)域的抗體。值得注意的是，靶向NTD的抗體不阻斷ACE2與RBD的相互作用，而是通過某些未知的中和機(jī)制發(fā)揮其抗病毒作用。
NAbs由于其出色的中和效率和成熟的工業(yè)化生產(chǎn)程序，可作為針對(duì)COVID-19的有效的治療方法。作者在文章中概述了新冠中和抗體在臨床的研究和應(yīng)用，例如CB6抗體在針對(duì)非人靈長類動(dòng)物的給藥中，表現(xiàn)出強(qiáng)大的體內(nèi)病毒抑制作用；開頭提到的再生元的雞尾酒抗體REGN10987+REGN10933則具有中和所有已鑒定病毒突變體的能力。同時(shí)作者也列舉了目前處在臨床試驗(yàn)狀態(tài)下的單克隆抗體（表1）。
最后，作者指出目前NAb治療新冠病毒所面臨的挑戰(zhàn)，包括ADE引發(fā)的病毒感染加重以及作為單鏈RNA病毒，高突變率可能導(dǎo)致病毒感染性及對(duì)抗體抗性的增加。并提出優(yōu)化動(dòng)物模型，使用雞尾酒療法的策略來應(yīng)對(duì)這些風(fēng)險(xiǎn)與挑戰(zhàn)。
多快？3-5個(gè)工作日完成！
多貴？低于700元/樣本的價(jià)格！
多準(zhǔn)？高于Sanger 的序列結(jié)果！
為什么選擇5’RACE方法進(jìn)行擴(kuò)展？
大家都知道， 分析可變區(qū)時(shí)，設(shè)計(jì)一個(gè)通用引物來擴(kuò)增所有的抗體序列是異常困難的。重鏈和輕鏈5’端的天然可變性決定了序列同源性很低。這也就決定了在5’端設(shè)計(jì)多條引物的多重PCR法，先天性地會(huì)遺漏部分抗體可變區(qū)序列，造成結(jié)果不夠全面。一個(gè)有效的分析這些可變區(qū)域的方法是在可變區(qū)下游的保守區(qū)設(shè)計(jì)簡并引物。后續(xù)可以使用5’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)方法克隆這段目的區(qū)域，之后再進(jìn)行測序。 使用SMARTer RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒，在反轉(zhuǎn)錄過程中將SMARTer II A寡核苷酸添加到cDNA的末端， 使得該位點(diǎn)能夠用于下游擴(kuò)增和克隆 。 使用SMARTer RACE kits具有足夠的靈敏度，可以獲得全部5’端的信息。
以合成的cDNA作為模板， 根據(jù)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫注冊(cè)的lgG的序列，設(shè)計(jì)了針對(duì)H鏈, L (κ)鏈, 或L (λ)鏈的反轉(zhuǎn)錄引物（RT primer）以及RACE PCR所需的反向引物（5′ RACE primer）進(jìn)行擴(kuò)增，得到帶有VDJ可變區(qū)全部序列的DNA片段。 取一部分PCR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)片段長度大小，應(yīng)集中于550bp長度附近。擴(kuò)增產(chǎn)物再進(jìn)行下一步的測序工作得到其對(duì)應(yīng)的抗體序列。
為什么選擇Miseq測序平臺(tái)？
Miseq測序平臺(tái)是illumina公司于2011年推出的小型測序平臺(tái)，并于2018年獲得中國國家藥品監(jiān)督管理局(CNDA)的批準(zhǔn)文書用于臨床體外診斷檢測。從推出至今，已服務(wù)超過十年的DNA測序需求，其數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度高，測序通量大和單堿基測序成本低等特點(diǎn)，持續(xù)地被各大醫(yī)院，臨檢公司等使用。
Miseq測序平臺(tái)是目前唯一能夠提供高質(zhì)量的600bp讀長的二代測序設(shè)備。這個(gè)讀長也正好滿足了上述5’RACE建庫得到的擴(kuò)增產(chǎn)物測序。由于Miseq測序平臺(tái)一次能夠完成對(duì)上千萬條片段進(jìn)行測序，其通量可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模單克隆樣本的測序或者免疫組庫測序，且其單位測序成本遠(yuǎn)低于Sanger方法的成本。
蘇州百達(dá)提供的服務(wù)
基于5’RACE全面準(zhǔn)確的建庫方法和Miseq測序平臺(tái)的高質(zhì)量，高通量的測序能力，我們能夠提供快速準(zhǔn)確地抗體基因發(fā)現(xiàn)服務(wù)：
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準(zhǔn)備樣本
準(zhǔn)備樣本應(yīng)該遵守代表性，準(zhǔn)確性，迅速性和低溫原則，保證所取樣本具有實(shí)驗(yàn)代表的科學(xué)意義，并能防止樣本在實(shí)驗(yàn)前降解，影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。
樣品包裝
- 利用鋁箔或進(jìn)口凍存管包裹樣本，用油性記號(hào)筆在其表面標(biāo)明樣本編號(hào)等信息，并且不要與乙醇等有機(jī)溶劑接觸；
- 不要用紗布（樣本易粘附在紗布上）、紙張（低溫凍存易碎）直接包裹樣本；
- 不要用玻璃或密封性不好的容器在液氮中保存樣本（玻璃器皿或密封性不好的容器從液氮中取出后會(huì)發(fā)生爆炸）；
- 樣本包裝不要使用透明膠帶（膠帶在低溫條件下粘性減弱，易掉落）；
- 不要把標(biāo)簽紙或其他紙制的說明性文件放入樣本袋內(nèi)，因?yàn)榧垙堅(jiān)谝旱幸姿椤?
樣本采集與存儲(chǔ)
- 組織樣本采集后，迅速放入進(jìn)口凍存管中，擰緊后立即放入液氮，再轉(zhuǎn)移到-80℃中保存；
- 細(xì)胞樣本去除培養(yǎng)液后，經(jīng) Trizol 或 Lysis/Binding Solution 處理后儲(chǔ)存于-80℃冰箱中或干冰運(yùn)輸。在-20℃冰箱中儲(chǔ)存不宜太久；懸浮細(xì)胞按照每 105-107 個(gè)細(xì)胞加 1ml的TRIzol 的比例加入 TRIzol 試劑，使用移液器 Tip 頭反復(fù)吹打細(xì)胞直至看不見成團(tuán)的細(xì)胞塊；貼壁細(xì)胞按每10cm2（相當(dāng)于六孔板一個(gè)孔或 35mm? 直徑培養(yǎng)皿）細(xì)胞加 1ml的TRIzol的比例加入 TRIzol 試劑 ；Trizol溶解細(xì)胞樣本進(jìn)行RNA提取，Trizol的量最好控制在1.5ml以內(nèi)，超過1.5ml時(shí)一個(gè)提取反應(yīng)體系無法全部提??；
- 未分離白細(xì)胞的全血樣本操作進(jìn)行RNA水平研究。建議在8小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行RNA提取，如果沒有RNA提取條件建議使用 PAXgene 全血采血管（BD）采血和保存；對(duì)于全血樣本，另外一個(gè)快速處理的方式就是將全血樣本直接按照體積1:5（Trizol越多越好）的方式投入到Trizol中，干冰運(yùn)輸就行，注意會(huì)有一定的降解風(fēng)險(xiǎn)，全血樣本需要500ul以上的量；
- 分離白細(xì)胞的全血樣本操作用于RNA水平研究 。全血樣本建議使用EDTA抗凝管采集， 并反復(fù)顛倒混勻幾次，使血液充分抗凝后，進(jìn)行白細(xì)胞分離處理，并將白細(xì)胞放入Trizol中， 使用移液器Tip頭反復(fù)吹打細(xì)胞，直至看不見成團(tuán)的細(xì)胞塊，使之充分溶解于 TRIzol 中形成清亮不粘稠的液體，并全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)記好的進(jìn)口凍存管，干冰運(yùn)輸或保存； ?推薦使用EDTA抗凝管采血，由于肝素會(huì)抑制下游PCR反應(yīng)，嚴(yán)禁使用肝素抗凝管采血；
- 單細(xì)胞處理及下游的RNA研究， 提前在200μL 的RNase-free平蓋低吸附PCR 管中分裝加入百達(dá)提供的10×Sample Buffer； 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，無菌條件分離出細(xì)胞移至200μL 的含有試劑的RNase-free平蓋低吸附PCR 管中（建議在分離單細(xì)胞時(shí)也設(shè)置自己的陰性對(duì)照，來幫助檢驗(yàn)自身的操作過程和實(shí)驗(yàn)環(huán)境是否有污染）；使用微量移液器輕輕吹打混勻，切勿渦旋；瞬時(shí)離心，將樣品收集至管底；將樣品用液氮速凍成型，或存放于-80℃冰箱中，保證管內(nèi)液體成固態(tài)。注意：細(xì)胞培養(yǎng)和分離過程中使用的培養(yǎng)基和其他試劑的組分可能會(huì)抑制下游的酶促反應(yīng)，因此，請(qǐng)盡量減少不必要的樣品體積，或使用無Ca2+ 、Mg2+的緩沖液漂洗細(xì)胞。
樣本運(yùn)輸
- 干冰運(yùn)輸
- 所有樣本（除去客戶需要保持活性的樣本）都可以用干冰運(yùn)輸，但用于RNA檢測的樣本必須使用干冰運(yùn)輸，用于DNA檢測的樣本可酌情處理；
- 24 小時(shí)到達(dá)的，干冰數(shù)量不得低于 5 公斤；大于24小時(shí)到達(dá)的，建議保證每天3公斤的干冰數(shù)量。夏季可以適當(dāng)再多增加部分干冰（平時(shí)的 1.5 倍）。
- 冰袋運(yùn)輸（能確保樣本在 24 小時(shí)內(nèi)送達(dá) ）
- 保存于 RNAlater 中的組織樣本 ；
- 保存于 TRIzol 中的細(xì)胞樣本或經(jīng)過勻漿的組織樣本；
- 用于抽提 DNA 的新鮮抗凝全血樣本或其他組織樣本；
- 溶于乙醇中的樣本或核酸。
快遞寄送
- 將用離心管儲(chǔ)存的樣品用封口膜密封或直接使用進(jìn)口凍存管儲(chǔ)存樣本，將所有樣本集中保存在一個(gè)或幾個(gè)自封袋/50ml離心管中，自封袋/離心管外標(biāo)記好客戶信息；
- 請(qǐng)仔細(xì)填寫快遞單，運(yùn)輸蘇州百達(dá)生物科技有限公司，建議順豐快遞郵寄。
- 收樣地址如下：
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收樣地址： 江蘇省蘇州市工業(yè)園區(qū)星湖街218號(hào)，生物納米園A5-505收件人：百達(dá)生物收樣室
電話： 177-0155-8215
郵編：215123
基于高通量測序的抗體文庫測序能夠檢測原始合成的抗體文庫抗體基因組成及各自豐度，用于實(shí)驗(yàn)前的QC工作。在進(jìn)行抗原篩選后，抗體文庫測序能夠發(fā)現(xiàn)與抗原高親和力結(jié)合的抗體序列，并用于下游優(yōu)化合成表達(dá)。
抗體文庫測序服務(wù)流程
以文庫DNA為起始材料，特異性擴(kuò)增BCR重鏈和輕鏈可變區(qū), 構(gòu)建測序文庫并進(jìn)行高通量測序。采用Illumina MiSeq 300PE平臺(tái)， 獲得完整的基因可變區(qū)；或采用PacBio三代測序獲得抗體轉(zhuǎn)錄本全長序列。
抗體文庫測序送樣要求
- DNA 樣品總量: ≥200 ng；菌體樣本：＞4ml（對(duì)數(shù)期）；
- 樣本物種包括：人，小鼠，豬，狗，駱駝等IMGI數(shù)據(jù)庫中已有參考抗體基因的物種。
抗體文庫測序周期和交付結(jié)果
- 交付周期：10-15個(gè)工作日；
- 測序數(shù)據(jù)量：重鏈輕鏈各自提供大約0.5-1百萬條測序讀長（0.5-1M)，全長三代測序提供5千-1萬條測序讀長序列；
- 交付結(jié)果：
- 基本數(shù)據(jù)QC及統(tǒng)計(jì)；
- 比對(duì)物種參考抗體基因序列庫并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；
- 克隆序列特征注釋： CDR1/2/3， FR1/2/3/4核酸序列，氨基酸序列注釋；
- 樣本克隆群體特征分析：CDR3序列長度分析，VDJ基因頻率統(tǒng)計(jì)及V-J基因組合頻率分析；
- 樣本間比較分析：測序飽和度分析，樣本間相關(guān)性分析等。
抗體文庫測序服務(wù)優(yōu)勢
- 全方位服務(wù)，提供從VDJ擴(kuò)增，建庫，測序和生信分析一站式服務(wù)；
- 采用準(zhǔn)確的擴(kuò)增引物體，全面提升可變區(qū)序列檢出；
- 豐富的分析內(nèi)容，提供可變區(qū)序列，抗體基因，多樣本比較等全方位分析服務(wù)；
- 合理的價(jià)格及快速的服務(wù)周期，幫助客戶提高生產(chǎn)效率。
我公司利用RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends)技術(shù)和公司特有的免疫組庫特異擴(kuò)增引物集進(jìn)行可變區(qū)的擴(kuò)增。通過利用Illumina Miseq測序平臺(tái)，能夠低成本和短周期的完成序列測序工作，得到全面準(zhǔn)確的B/T淋巴細(xì)胞可變區(qū)組成及多樣性信息。當(dāng)前，我司提供人，小鼠，豬，狗，駱駝和兔物種的BCR免疫組測序，及人和小鼠的TCR免疫組庫測序。
免疫組庫測序服務(wù)流程
以RNA為起始材料，使用RACE法對(duì)BCR重鏈/輕鏈，TCR alpha/beta鏈分別構(gòu)建測序文庫，然后采用Illumina MiSeq 300PE平臺(tái)，獲得完整的基因可變區(qū)序列。
免疫組庫測序送樣要求
- RNA 樣品總量: ≥2 μg；組織樣本（動(dòng)物）：>300 mg；細(xì)胞樣本：>10萬個(gè)；
- 提供樣本來源的種屬信息 。
免疫組庫測序周期和交付結(jié)果
- 交付周期：10-15個(gè)工作日；
- 測序數(shù)據(jù)量：重鏈輕鏈各自提供大約0.5-1百萬條測序讀長（0.5-1M)；
- 交付結(jié)果：
- 基本數(shù)據(jù)QC及統(tǒng)計(jì)；
- 比對(duì)物種參考抗體基因序列庫并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；
- 克隆序列特征注釋： CDR1/2/3， FR1/2/3/4核酸序列，氨基酸序列注釋；
- 樣本克隆群體特征分析：CDR3序列長度分析，VDJ基因頻率統(tǒng)計(jì)及V-J基因組合頻率分析；
- 樣本間比較分析：測序飽和度分析，樣本間相關(guān)性分析等。
免疫組庫測序服務(wù)優(yōu)勢
- 全方位服務(wù)，提供從VDJ擴(kuò)增，建庫，測序和生信分析一站式服務(wù)；
- 采用特有的5′ RACE擴(kuò)增技術(shù)，及準(zhǔn)確的擴(kuò)增引物體，全面提升可變區(qū)序列檢出；
- 采用分子標(biāo)簽（UMI)的擴(kuò)增技術(shù)，降低因擴(kuò)增效率不同所引起的豐都差異；
- 豐富的分析內(nèi)容，提供可變區(qū)序列，抗體基因，多樣本比較等全方位分析服務(wù)；
- 合理的價(jià)格及快速的服務(wù)周期，幫助客戶提高生產(chǎn)效率。
在國家新藥創(chuàng)制重大科技專項(xiàng)、藥品監(jiān)管改革、醫(yī)保制度改革和科技金融創(chuàng)新的合力助推下，我國生物醫(yī)藥迎來蓬勃發(fā)展、量質(zhì)齊升的可喜局面。
只要繼續(xù)深化改革，不斷完善創(chuàng)新生態(tài)，中國新藥研發(fā)未來可期。
最近一段時(shí)間，生物醫(yī)藥領(lǐng)域好消息不斷：中國生物和北京科興自主研發(fā)的新冠疫苗，在越來越多的國家接種，為全球抗疫繼續(xù)貢獻(xiàn)中國智慧；百濟(jì)神州自主研發(fā)的一款抗癌新藥的海外權(quán)益，以超過22億美元的總交易金額授權(quán)全球制藥巨頭諾華，創(chuàng)造了中國新藥出海的又一里程碑……
包括疫苗在內(nèi)的生物醫(yī)藥是不折不扣的高新科技產(chǎn)品，小小一片藥丸、一劑疫苗，凝結(jié)著眾多科學(xué)家和技術(shù)工程人員的心血。
黨的十八大以來，在國家新藥創(chuàng)制重大科技專項(xiàng)、藥品監(jiān)管改革、醫(yī)保制度改革和科技金融創(chuàng)新的合力助推下，我國生物醫(yī)藥迎來蓬勃發(fā)展、量質(zhì)齊升的可喜局面。
一方面，包括免疫治療、細(xì)胞治療在內(nèi)的前沿技術(shù)多點(diǎn)開花，創(chuàng)新藥逐年增多。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2018至2020年共有37個(gè)一類創(chuàng)新藥獲準(zhǔn)上市，由此前的平均1年1個(gè)增加到1月1個(gè)。
另一方面，創(chuàng)新實(shí)力不斷提升，快跟式創(chuàng)新的速度明顯加快，圍繞新靶點(diǎn)、新機(jī)制研發(fā)的原研藥陸續(xù)進(jìn)入臨床試驗(yàn)，有望在腫瘤、乙肝、肺纖維化、老年癡呆等重大疾病的治療上大顯身手。
隨著創(chuàng)新藥開花結(jié)果，其社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益逐漸顯現(xiàn)。越來越多的國產(chǎn)新藥以良好的安全性、治療效果和較低的價(jià)格，逐步替代昂貴的進(jìn)口藥，在造?；颊叩耐瑫r(shí)顯著降低了醫(yī)療負(fù)擔(dān)。
與此同時(shí)，一批具備創(chuàng)新實(shí)力的新興生物技術(shù)公司脫穎而出，成為創(chuàng)新大軍中生機(jī)勃發(fā)的重要力量。有專家預(yù)言，繼互聯(lián)網(wǎng)、信息通信、新能源等之后，生物醫(yī)藥有望成為支撐我國經(jīng)濟(jì)高質(zhì)量發(fā)展的又一新興戰(zhàn)略性產(chǎn)業(yè)。
當(dāng)然，我們既要看到成績也要正視不足。
我國從仿制藥大國邁向創(chuàng)新藥大國的轉(zhuǎn)型才剛開始，無論是基礎(chǔ)研究、工程技術(shù)還是企業(yè)規(guī)模，與世界創(chuàng)新藥強(qiáng)國相比還有很大差距。
與此同時(shí)，醫(yī)藥領(lǐng)域的制度創(chuàng)新還滯后于科技創(chuàng)新的步伐。作為政府嚴(yán)格監(jiān)管的特殊商品，藥品對(duì)于政策的依賴性更強(qiáng)；對(duì)于周期長、風(fēng)險(xiǎn)高、投資大的新藥研發(fā)來說，政策保障尤為關(guān)鍵。
當(dāng)前，在藥品臨床審評(píng)、上市審批和臨床試驗(yàn)管理、國家醫(yī)保等關(guān)鍵環(huán)節(jié)還存在一些堵點(diǎn)，影響新藥研發(fā)的速度和質(zhì)量。
“改革道路上仍面臨著很多復(fù)雜的矛盾和問題，我們已經(jīng)啃下了不少硬骨頭但還有許多硬骨頭要啃，我們攻克了不少難關(guān)但還有許多難關(guān)要攻克?！绷?xí)近平總書記在主持中央全面深化改革委員會(huì)第十七次會(huì)議時(shí)強(qiáng)調(diào)，要把深化改革攻堅(jiān)同促進(jìn)制度集成結(jié)合起來，聚焦基礎(chǔ)性和具有重大牽引作用的改革舉措，加強(qiáng)制度創(chuàng)新充分聯(lián)動(dòng)和銜接配套，提升改革綜合效能。
包括疫苗在內(nèi)的生物醫(yī)藥是事關(guān)國計(jì)民生和國家安全的戰(zhàn)略性高科技產(chǎn)業(yè)。新藥研發(fā)涉及科技、藥監(jiān)、醫(yī)保、衛(wèi)生醫(yī)療等多個(gè)政府部門，政策的協(xié)同性、配套性尤顯重要。只要繼續(xù)深化改革、持續(xù)完善創(chuàng)新生態(tài)，中國新藥研發(fā)未來可期。
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